一、细胞凋亡概念：

细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关, 近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 

GeneCopoeia 公司拥有最方便、最效率的凋亡检测试剂盒，涵盖的检测类型多种多样，您可以在不同水平上实时检测凋亡的发生进程。

二、细胞凋亡的检测方法：

1. 磷酯酰丝氨酸 (PS) 外翻法 (Annexin V 法)

在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白 V 可与暴露在质膜外侧的 PS 结合，用于识别凋亡细胞。碘化丙啶 (propidine iodide, PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

GeneCopoeia 公司开发了一系列 Annexin V 标记产品，具有特异性高、荧光信号强等优点，制备出的样品可适用于荧光显微镜和流式分析。

应用实例：以 GeneCopoeia 公司 FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子
 

 

2. Caspase-3 活性的检测

半胱氨酸蛋白酶 caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中 caspase-3 的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3 正常以酶原（32KDa）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KDa）和两个小亚基（12KDa）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

荧光法检测 Caspase-3 活性: 

GeneCopoeia 公司提供的 Caspase-3 Z-DEVD-R110 Assay Kit， 是以 Z-DEVD-R110 为酶的特异性底物的。其中，R11O 与短肽 DEVD 通过两个酰胺键共价相连。由于 DEVE 的存在，抑制了 R11O 的荧光活性。在 Caspase 3 催化下, Z-DEVD-R110 经过两步逐渐打开共价键，释放出能够发射强烈荧光的 R110。通过检测 R110 的荧光变化来判断 caspase-3 的活性。
 

 

应用实例：GeneCopoeia 公司的 Caspase-3/7 Z-DEVD-R110 Assay Kit 为例
 

 
 

活细胞 caspase 活性检测：

GeneCopoeia 公司提供的 LIVE Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Kit 是一种简单的、免洗的，已经进行优化测试的细胞凋亡检测试剂盒，可以对微孔板中的活细胞进行实时监测，并能实时检测活细胞、凋亡细胞的荧光强度。这种具有膜亲和型的检测试剂盒是由一个 4 氨基的短肽 DEVD 和一种核酸结合染料。凋亡发生时,Caspase3/7 蛋白被激活，从而剪切 Caspase3/7 识别序列 DEVD。剪切底物后，游离的核酸染料与 DNA 结合，从而发出亮绿色荧光信号。

使用范围：使用于活细胞、固定细胞的细胞成像分析
检测平台：荧光显微镜；荧光酶标仪

3. 线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位Δψm 是一个体现细胞健康水平的线粒体功能性参数。线粒体膜电位在细胞凋亡发生时，会受到干扰破坏。这种膜电位变化可以通过荧光探针 JC-1 来检测。在健康细胞中，线粒体膜电位水平高，JC-1 进入细胞后容易在线粒体中富集成为多聚体，呈现红色荧光。而在凋亡或疾病细胞中，线粒体膜电位下降，JC-1 以单体形式出现，发出绿色荧光。利用 JC-1 探针荧光信号的变化来检测凋亡细胞中线粒体膜电位的变化是快速简单有效的检测方法。JC-1 比 DiOC6(3) 以及罗丹明 123 更敏感和稳定。

GeneCopoeia 公司的 JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒提供线粒体检测所需的必需试剂，可以用来检测细胞的线粒体完整性分析。

应用实例：GeneCopoeia 公司的 JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit 为例
 

 

图 3. 使用 JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit (A048) 检测 Jurkat 凋亡细胞中线粒体膜电位的变化。左图为正常 Jurkat 细胞 (对照) 流式细胞图，右图为使用 10µM camptothecin 诱导 4 小时后 Jurkat 细胞流式细胞图。

4. TUNEL 法

细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。细胞凋亡时抽提 DNA 进行电泳检测，可以发现 180-200bp 的 DNA ladder。基因组 DNA 断裂时，暴露的 3』-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上绿色荧光探针荧光素 (FITC) 标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

GeneCopoeia 公司开发了一系列灵敏度高多色荧光 TUNEL 检测试剂盒，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片及细胞的凋亡测定。
 

 

应用实例：以 GeneCopoeia 公司的 TUNEL Andy Fluor™ 488 细胞凋亡检测试剂盒为例。
 

 
 

图 4. 使用 TUNEL Andy Fluor™ 488 细胞凋亡检测试剂盒进行老鼠舌组织细胞凋亡检测结果。

 

三、细胞凋亡分析试剂盒的比较