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慢病毒感染目的细胞实验步骤
人阅读 发布时间：2016-08-24 09:19
1. 感染预实验
以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）
Day1：
准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种 5×104 个细胞，添加细胞培养液至 500µL。通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）
Day2：
（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：
A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；
B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；
C. 混匀后，细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。
Day3：
更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。）
Day4：
继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。
Day5：
观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。）
根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出最适合目的细胞的 MOI 值。
图 1. H1299 细胞的 MOI 梯度摸索结果示例
示例中使用的慢病毒颗粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10 8TU/mL），曝光时间 1s，显微倍数 100×。从上图可见第 2 组细胞的感染效率已达到 90%。由于慢病毒颗粒对细胞有一定毒性，当 MOI 值过高时，继续添加慢病毒颗粒，感染效率没有明显增加，且细胞状态容易变差、皱缩甚至死亡。
荧光报告基因和目的基因的相对表达并不总是成等比关系的。在有的情况下，即使荧光报告基因表达较低或无表达，目的基因依然能够表达；反之亦然。所以在观察荧光效果后，建议使用 qRT-PCR 作进一步鉴定。
图 2. 293T 细胞的 MOI 梯度摸索结果示例
示例中使用的慢病毒颗粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×108TU/mL），曝光时间 0.6s，显微倍数 100×。从上图可见第 2 组细胞的感染效率已达到 80%。由于慢病毒颗粒对细胞有一定毒性，当 MOI 值过高时，继续添加慢病毒颗粒，感染效率没有明显增加，且细胞状态容易变差、皱缩甚至死亡。
2. 摸索细胞的最适药物筛选浓度
细胞的种类与状态均会影响慢病毒颗粒转导效率，部分细胞可能与慢病毒颗粒有相互抵抗的现象，导致感染效率低。当您在感染后 72、96 小时后发现感染效果仍不理想，建议对感染后的细胞进行药物筛选（药筛），以收集较多感染成功的细胞。
慢病毒颗粒携带的基因整合到目的细胞基因组是随机发生的非同源性重组，当抗性基因表达时，目的基因不一定也能表达，在进行药筛处理后，还要以 qRT-PCR 作进一步鉴定。
在进行正式的抗生素筛选前，建议您先对空白细胞的最小致死浓度进行摸索、优化。
以 293T 细胞+Puromycin 为例，从相关文献查得 Puromycin 对 293T 细胞的最小致死浓度为 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多设置几个浓度梯度，可以得出较精确的的筛选浓度。
（1）准备 24 孔培养板，按每孔 1-5×104 细胞数 (约等于 20%-35% 融合度) 接种 293T 空白细胞，对其中 6 个孔进行铺板；
（2）一般 Puromycin 母液的浓度是 10 mg/mL，用细胞培养基将 Puromycin 母液稀释 1000 倍，可获得终浓度为 10 µg/mL 的 Puromycin 稀释液；
（3）按表 5 所示，每孔添加相应的细胞培养基和 Puromycin；
（4）24 孔培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，培养过夜；
（5）按表 4 的药筛时间和观察时间建议，定期在荧光显微镜下观察细胞状态。
当空白细胞刚好能全部死亡时，该浓度的抗生素可作为最适药筛浓度。
注：以上表格的设置仅供参考。通常即使细胞一样，由于培养的条件和传代次数不一样，筛选浓度亦不一样。可根据试验结果进行更进一步的细化浓度梯度设置。 如果药筛过程中细胞量较少，为保持细胞的数一定，一般不换液，只有在稳转株药筛过程中，根据细胞生长速度，3-4 天换液一次。
如果目的细胞较难感染，一次感染不能达到预期效果时，在感染 3 天后可对目的细胞进行药筛处理，获得较多被感染的细胞，如以下例子所示：
图 3. 人食管癌细胞 CE-81T（贴壁细胞）的药筛前后效果对比
图 4. 人骨肉瘤细胞 Hos（贴壁细胞）的药筛前后效果对比
图 5. 人白血病 K562（悬浮细胞）的药筛前后效果对比
图 6. 293T 细胞在不同融合度的明视野效果（放大倍数：100×）
3. 实验体系的放大和正式实验
根据预实验结果，放大慢病毒颗粒细胞感染实验，实施正式实验。
通过慢病毒颗粒感染细胞的预实验，我们大致获得慢病毒颗粒感染目的细胞的优化条件。正式实验所用的细胞数往往比预实验多，慢病毒颗粒用量也需要适当放大。放大原则是保持细胞密度一致，按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大培养液体积和慢病毒颗粒用量。有两种放大方法可供参考：
按底面积放大（适用于贴壁细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和底面积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和底面积成正比。假设预实验使用 96 孔板（底面积 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（底面积 10 cm2），则：
底面积的放大倍数 ≈ 33
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×33 = 33 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：请确保细胞均匀、单层分布，不成簇生长。
按培养体积放大（适用于悬浮细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和感染体积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和培养液体积成正比。假设预实验使用 96 孔板（培养体积 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（培养体积 2 mL），则：
培养体积的放大倍数 = 20
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×20 = 20 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：请确保细胞生长状态良好。
以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）
Day1：
准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种 5×104 个细胞，添加细胞培养液至 500µL。通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）
Day2：
（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：
A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；
B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；
C. 混匀后，细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。
Day3：
更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。）
Day4：
继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。
Day5：
观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。）
根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出最适合目的细胞的 MOI 值。
图 1. H1299 细胞的 MOI 梯度摸索结果示例
荧光报告基因和目的基因的相对表达并不总是成等比关系的。在有的情况下，即使荧光报告基因表达较低或无表达，目的基因依然能够表达；反之亦然。所以在观察荧光效果后，建议使用 qRT-PCR 作进一步鉴定。
图 2. 293T 细胞的 MOI 梯度摸索结果示例
2. 摸索细胞的最适药物筛选浓度
细胞的种类与状态均会影响慢病毒颗粒转导效率，部分细胞可能与慢病毒颗粒有相互抵抗的现象，导致感染效率低。当您在感染后 72、96 小时后发现感染效果仍不理想，建议对感染后的细胞进行药物筛选（药筛），以收集较多感染成功的细胞。
慢病毒颗粒携带的基因整合到目的细胞基因组是随机发生的非同源性重组，当抗性基因表达时，目的基因不一定也能表达，在进行药筛处理后，还要以 qRT-PCR 作进一步鉴定。
在进行正式的抗生素筛选前，建议您先对空白细胞的最小致死浓度进行摸索、优化。
表 4. 抗生素筛选细胞的相关参考值
以 293T 细胞+Puromycin 为例，从相关文献查得 Puromycin 对 293T 细胞的最小致死浓度为 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多设置几个浓度梯度，可以得出较精确的的筛选浓度。
（1）准备 24 孔培养板，按每孔 1-5×104 细胞数 (约等于 20%-35% 融合度) 接种 293T 空白细胞，对其中 6 个孔进行铺板；
（2）一般 Puromycin 母液的浓度是 10 mg/mL，用细胞培养基将 Puromycin 母液稀释 1000 倍，可获得终浓度为 10 µg/mL 的 Puromycin 稀释液；
（3）按表 5 所示，每孔添加相应的细胞培养基和 Puromycin；
（4）24 孔培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，培养过夜；
（5）按表 4 的药筛时间和观察时间建议，定期在荧光显微镜下观察细胞状态。
当空白细胞刚好能全部死亡时，该浓度的抗生素可作为最适药筛浓度。
表 5. 药物筛选浓度梯度参考（Puromycin）
* 表格中使用的 Puromycin 浓度为 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以细胞培养液稀释 1000 倍所得。
注：以上表格的设置仅供参考。通常即使细胞一样，由于培养的条件和传代次数不一样，筛选浓度亦不一样。可根据试验结果进行更进一步的细化浓度梯度设置。 如果药筛过程中细胞量较少，为保持细胞的数一定，一般不换液，只有在稳转株药筛过程中，根据细胞生长速度，3-4 天换液一次。
如果目的细胞较难感染，一次感染不能达到预期效果时，在感染 3 天后可对目的细胞进行药筛处理，获得较多被感染的细胞，如以下例子所示：
图 3. 人食管癌细胞 CE-81T（贴壁细胞）的药筛前后效果对比
图 4. 人骨肉瘤细胞 Hos（贴壁细胞）的药筛前后效果对比
图 5. 人白血病 K562（悬浮细胞）的药筛前后效果对比
附：细胞融合度参考
图 6. 293T 细胞在不同融合度的明视野效果（放大倍数：100×）
3. 实验体系的放大和正式实验
根据预实验结果，放大慢病毒颗粒细胞感染实验，实施正式实验。
通过慢病毒颗粒感染细胞的预实验，我们大致获得慢病毒颗粒感染目的细胞的优化条件。正式实验所用的细胞数往往比预实验多，慢病毒颗粒用量也需要适当放大。放大原则是保持细胞密度一致，按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大培养液体积和慢病毒颗粒用量。有两种放大方法可供参考：
按底面积放大（适用于贴壁细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和底面积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和底面积成正比。假设预实验使用 96 孔板（底面积 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（底面积 10 cm2），则：
底面积的放大倍数 ≈ 33
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×33 = 33 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：请确保细胞均匀、单层分布，不成簇生长。
按培养体积放大（适用于悬浮细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和感染体积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和培养液体积成正比。假设预实验使用 96 孔板（培养体积 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（培养体积 2 mL），则：
培养体积的放大倍数 = 20
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×20 = 20 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：请确保细胞生长状态良好。
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