一、如何添加最优化的慢病毒量？确定靶细胞 MOI 值

不论是对活体还是体外培养的哺乳动物细胞，慢病毒表达载体对遗传物质的转导效率至关重要。慢病毒最早起源于人免疫缺陷病毒 (HIV) 或猫免疫缺陷病毒（FIV），能够感染几乎所有类型的细胞，包括难以用质粒转染甚至无法用质粒转染的细胞。

许多客户对如何用慢病毒颗粒进行转导持有疑问，特别是对如何选择适合的慢病毒量感到困惑。这个问题可根据确定细胞的最佳感染复数（Multiplicity of Infection, MOI）来解决。

滴度与 MOI？

TU/mL 是目前使用最广泛的慢病毒颗粒滴度单位，「TU」为「Transduction Units」的缩写，表示可成功转导目的细胞的基因组数。

选购慢病毒颗粒之前，首先需了解目的细胞的最佳感染复数：MOI。MOI 的概念很简单，可有效感染细胞的慢病毒颗粒数与被感染细胞数的比值即为该细胞的 MOI 值。例如，应用 106 TU 慢病毒感染 106 个细胞可成功使 80% 以上细胞达到转导目的时，MOI=1；如需要以 5 × 106 TU 病毒才可成功感染 106 个细胞，则 MOI = 5。（TU/mL 为慢病毒滴度单位，TU 表示有活性的慢病毒量）

如何确定目的细胞的 MOI 值?

慢病毒对不同类型细胞的转导效率各不相同，因此 MOI 也各异。在此，我们列出了多种常用细胞系的 MOI，助您选购合适的慢病毒量。下表是 GeneCopoeia 通过实验摸索得出的多种细胞系的 MOI 参考值。
请注意：上表所示的 MOI 值仅供您选购慢病毒时作为用量参考。根据细胞状态、操作手法等的差别，实际数据可能有轻微浮动。所以当您收到所购买的慢病毒时，我们仍然建议您通过设计梯度 MOI 感染小量细胞实验（如：MOI = 0.3, 1, 3, 5, 10, etc.）检测目的细胞的转导效率，确认其 MOI 值。另外，若您的实验细胞未被列在上表中，梯度实验确定最佳 MOI 是至关重要，甚至必不可少的。您可将病毒进行梯度稀释，分别感染等量的细胞（见图 1）。
 
进行转导的 1 天前，于 96 孔板铺板培养目的细胞 (实例中使用了 H1299 细胞)；在进行转导当天，以 10 倍梯度稀释慢病毒并分别进行转导；转导 72 小时后以荧光显微镜观察 GFP 报告基因表达情况，确定该细胞在最佳转导效果下的慢病毒量。

最后，若您的实验细胞要求较高的 MOI 值, 您还可通过以下几种方法将其降低。方法一是加入 polybrene (hexadimethrine bromide), 一种能够减少病毒与细胞膜间电荷排斥作用的阳离子聚合物。另一种方法是使用能够捕获慢病毒颗粒的磁珠（例如，利用磁珠可成功地将 MM-AN 细胞的 MOI 从 16 降到 4）。购买或构建克隆时，可选择载体骨架上带有标记基因（如：Puromycin, Neomycin 等）的克隆，可方便后续进行药物筛选，建立将目的基因成功地随机整合到特定细胞的稳定细胞株。

二、慢病毒感染目的细胞实验步骤

1. 感染预实验

以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）

Day1：
准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种 5×104 个细胞，添加细胞培养液至 500µL。通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）

Day2：
（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：
A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；
B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；
C. 混匀后，细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。

Day3：
更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。）

Day4：
继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。

Day5：
观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。）

根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出最适合目的细胞的 MOI 值。
  示例中使用的慢病毒颗粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10 8TU/mL），曝光时间 1s，显微倍数 100×。从上图可见第 2 组细胞的感染效率已达到 90%。由于慢病毒颗粒对细胞有一定毒性，当 MOI 值过高时，继续添加慢病毒颗粒，感染效率没有明显增加，且细胞状态容易变差、皱缩甚至死亡。

荧光报告基因和目的基因的相对表达并不总是成等比关系的。在有的情况下，即使荧光报告基因表达较低或无表达，目的基因依然能够表达；反之亦然。所以在观察荧光效果后，建议使用 qRT-PCR 作进一步鉴定。
  示例中使用的慢病毒颗粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×108TU/mL），曝光时间 0.6s，显微倍数 100×。从上图可见第 2 组细胞的感染效率已达到 80%。由于慢病毒颗粒对细胞有一定毒性，当 MOI 值过高时，继续添加慢病毒颗粒，感染效率没有明显增加，且细胞状态容易变差、皱缩甚至死亡。

2. 摸索细胞的最适药物筛选浓度

细胞的种类与状态均会影响慢病毒颗粒转导效率，部分细胞可能与慢病毒颗粒有相互抵抗的现象，导致感染效率低。当您在感染后 72、96 小时后发现感染效果仍不理想，建议对感染后的细胞进行药物筛选（药筛），以收集较多感染成功的细胞。

慢病毒颗粒携带的基因整合到目的细胞基因组是随机发生的非同源性重组，当抗性基因表达时，目的基因不一定也能表达，在进行药筛处理后，还要以 qRT-PCR 作进一步鉴定。

在进行正式的抗生素筛选前，建议您先对空白细胞的最小致死浓度进行摸索、优化。
 
以 293T 细胞+Puromycin 为例，从相关文献查得 Puromycin 对 293T 细胞的最小致死浓度为 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多设置几个浓度梯度，可以得出较精确的的筛选浓度。

（1）准备 24 孔培养板，按每孔 1-5×104 细胞数 (约等于 20%-35% 融合度) 接种 293T 空白细胞，对其中 6 个孔进行铺板；

（2）一般 Puromycin 母液的浓度是 10 mg/mL，用细胞培养基将 Puromycin 母液稀释 1000 倍，可获得终浓度为 10 µg/mL 的 Puromycin 稀释液；

（3）按表 5 所示，每孔添加相应的细胞培养基和 Puromycin；

（4）24 孔培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，培养过夜；

（5）按表 4 的药筛时间和观察时间建议，定期在荧光显微镜下观察细胞状态。
当空白细胞刚好能全部死亡时，该浓度的抗生素可作为最适药筛浓度。
  * 表格中使用的 Puromycin 浓度为 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以细胞培养液稀释 1000 倍所得。

注：以上表格的设置仅供参考。通常即使细胞一样，由于培养的条件和传代次数不一样，筛选浓度亦不一样。可根据试验结果进行更进一步的细化浓度梯度设置。 如果药筛过程中细胞量较少，为保持细胞的数一定，一般不换液，只有在稳转株药筛过程中，根据细胞生长速度，3-4 天换液一次。

如果目的细胞较难感染，一次感染不能达到预期效果时，在感染 3 天后可对目的细胞进行药筛处理，获得较多被感染的细胞，如以下例子所示：
 
3. 实验体系的放大和正式实验；

根据预实验结果，放大慢病毒颗粒细胞感染实验，实施正式实验。

通过慢病毒颗粒感染细胞的预实验，我们大致获得慢病毒颗粒感染目的细胞的优化条件。正式实验所用的细胞数往往比预实验多，慢病毒颗粒用量也需要适当放大。放大原则是保持细胞密度一致，按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大培养液体积和慢病毒颗粒用量。有两种放大方法可供参考：

按底面积放大（适用于贴壁细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和底面积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和底面积成正比。假设预实验使用 96 孔板（底面积 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（底面积 10 cm2），则：
底面积的放大倍数 ≈ 33
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×33 = 33 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：请确保细胞均匀、单层分布，不成簇生长。

按培养体积放大（适用于悬浮细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和感染体积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和培养液体积成正比。假设预实验使用 96 孔板（培养体积 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（培养体积 2 mL），则：
培养体积的放大倍数 = 20
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×20 = 20 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：请确保细胞生长状态良好。

三、使用慢病毒的常见问题

1. 怎样购买份量合适数量的慢病毒颗粒？

一套完整实验所需的慢病毒颗粒包括：1. 含有目的基因的慢病毒颗粒，2. 阴性对照慢病毒颗粒，3. 用于预实验的阳性对照慢病毒颗粒。

购买时可以根据目的细胞特性、检测方法、培养器皿估算慢病毒颗粒的最佳用量，避免剩余的大量慢病毒颗粒超出最佳保存期；此外，GeneCopoeiaTM 同时提供高滴度低价格的阳性对照慢病毒颗粒，帮助您以较低的预算和较充足的材料完成预实验的条件探索。初次使用慢病毒颗粒的研究者也可使用阳性对照慢病毒颗粒熟悉实验过程。

2. 慢病毒颗粒可以用于动物体内（In vivo）实验吗？

GeneCopoeiaTM 提供的即用型慢病毒颗粒全部经过纯化、浓缩处理，去除了细胞碎片等杂质，进一步降低免疫原性，适用于各类活体动物注射实验和成瘤实验。

3. 慢病毒颗粒对目的细胞的感染效率很低，如何提高感染效率？

提高感染效率的前提是保证细胞生长状态良好。其次，可以通过提高 MOI 值来提高感染效率，也可以在培养基中加入 Polybrene (4-10 µg/mL) 提高感染效率。

4. 添加慢病毒颗粒后，细胞为什么大量死亡?

慢病毒颗粒对靶细胞有一定毒性。添加量过多、感染时间过长都可能对目的细胞 造成伤害。如遇上这种情况，建议您降低 MOI 值，并在感染细胞 4-8 小时后进行换 液（以新鲜的全培养基替换含慢病毒颗粒的旧培养基），最长换液时间不可大于 12 小时。

5.Polybrene 是什么？在慢病毒颗粒感染中，Polybrene 添加越多越好吗？

Polybrene 是常用的感染添加剂，通常的使用浓度为 4-10 µg/mL，Polybrene 能 显著提高慢病毒的感染效率，通常能提高感染效率 2-10 倍，对部分细胞甚至可 提高感染效率 10-20 倍。当目的细胞 MOI 高于 20 时，我们建议在培养基中加入 Ploybrene(约 4-10 µg/mL) 适当提高感染效率。

然而，Polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对 Polybrene 的敏感度和耐受性不同，部分细胞对 Polybrene 反应明显，容易导致细胞状态变差、形态发生变化、甚至死亡，因此并非每种细胞都适合添加 Polybrene。

在正式使用 Polybrene 前，建议在 1-10 µg/mL 范围内设置梯度，观察细胞在该浓度下，24 小时后是否仍保持健康生长，从而确定该细胞的最适 Polybrene 浓度。

6. 目的细胞可以被慢病毒颗粒感染，但 eGFP 的荧光强度很低，为什么？

在目的细胞被慢病毒颗粒感染过程中，eGFP 荧光强度取决于病毒感染细胞内的慢病毒颗粒数、细胞本身的状态、细胞类型以及观察时间等。一般情况下，目的细胞感染慢病毒颗粒数越多，细胞增殖越快，eGFP 荧光会较强。慢病毒携带基因表达时间较长，一般在增殖较快的细胞中也需要感染 72-96 小时才会到达 eGFP 的表达高峰。对于增殖较慢的细胞，感染时间则需更长。建议如果您的细胞在感染后观察的荧光强度较低，建议继续培养一段时间再观察。

7. 进行慢病毒颗粒感染后，为什么目的细胞用 qPCR 检测不到目的基因表达量的变化？

如果使用的检测方法是 qPCR，原因可能是目的基因含特殊序列结构、或与目的细胞系统不能兼容的问题，导致转录受影响，建议同时培养、感染目的细胞和 293T 工具细胞，同时进行检测，如目的基因在 293T 细胞转录不受影响，则可能为目的基因与目的细胞的相互作用导致转录受阻。

8. 慢病毒颗粒在储存期间不慎染菌，还可以继续使用吗？

如慢病毒颗粒不慎染菌，且实验材料有限，可以使用 0.45 µm 滤膜对慢病毒进行滤菌操作。当然，该操作会导致一定程度的滴度损失及慢病毒颗粒总量损失。如条件允许，建议重新购买该种慢病毒。

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